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高通量|这才是藻类研究真正需要的一款工具!

时间:2022-07-05  点击次数:95

ROTOR+最初是为芽殖酵母(酿酒酵母)遗传学而设计。对莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)进行大规模的遗传筛选,ROTOR+的功能可以发挥很大的作用。然而,衣藻与出芽酵母菌在细胞大小、生长速度、菌落形态和粘附性以及光响应性方面存在差异。因此,ROTOR+能否适用于衣藻类研究成为了关键。

因此在测试过程中要解决的下面的问题显得尤为重要:

Q1:细胞是否通过ROTOR+可靠地从液体或固体介质中挑取到RePads复制针板上,在针头之间、针板之间、不同平板间,细胞的数量/密度是否可以再生?

A1:可重复性挑取和接种的细胞数量,取决于细胞的表面特性:有多粘稠,粘附(或被排斥)在琼脂表面的程度等等。衣藻在这些特性上不同于酵母。例如,在使用丝绒(酵母的标准方法)进行复制时,衣藻菌落有很强的倾向,要么完全粘在平板上,要么完全转移到丝绒上。

Q2:细胞在此过程中是否保持高活力?

A2:转移的细胞保持高活力显然是必要的。从我们最初的工作中可以清楚地看出,在许多方面,衣藻在某些操作过程中比酵母菌或大肠杆菌更容易受到损伤。例如,当从琼脂上挑取到玻璃或不锈钢针上时,衣藻在空气中大约40秒后就会几乎完全丧失生存能力。

Q3:针头之间、源板之间或靶板之间是否有明显的交叉污染?

A3:根据生物体的特性,可以很容易地想象,活细胞气溶胶可以通过ROTOR+复制操作传播,导致交叉污染和破坏实验。

Q4:使用ROTOR+可以可靠接种和区分的菌落最大密度是多少?

A4:菌落可以被接种的最大密度取决于生物体的大小和生长速度,并将影响对生物体进行筛选的通量。

首先通过ROTOR+对液体到琼脂的转移展开相关实验。

用Singer PlusPlates方板,注入50ml的TAP琼脂(标准衣藻培养基),并添加了50μg/ml氨苄西林来抑制细菌污染。由于衣藻在液体介质中具有很强的流动性,对光线也有很强的敏感性,因此需要将ROTOR+上的内部光源取下,并在操作过程中尽可能遮挡光线。如果没有这种预防措施,藻类会在源板的不同区域强烈聚集,会严重影响整个板的菌落再现性。

用一个注入25ml TAP的液体培养基平板,其中含有约10^6cells/ml湿的衣藻(cc-124背景),用384RePad长针,从液体到琼脂,从384密度排列成1536密度,(针重复利用)。在33°C强光照下培养3天(图1A),每隔一段时间显微镜观察。

图1:液体到琼脂转移

可以看到菌落具有明显的活力,基本上每个细胞被接种18小时都形成了一个微菌落(图1C)。平板的图像显示了接种区域的再生性,不同平板之间也观察到良好的再生性。

另一方面,在这种固定密度下,菌落之间有明显的空间分隔,中间没有污染的菌落产生。

ROTOR+从挑取到接种需要5-10秒。为了测定在空气中RePad上的衣藻活力,在挑取衣藻后和接种前分别暂停0、10、20和40秒,转移的细胞数量及培养后的活力基本保持不变。从含有50ml细胞悬浮液的SINGER平板中,测试了液体到琼脂的转移,结果基本相同,表明了有效液滴大小与针插入的液体深度几乎无关。

接下来通过ROTOR+从琼脂到琼脂的转移展开实验。

以含有TAP琼脂的Singer PlusPlate方板为来源板,上有cc-124背景的衣藻菌膜。使用384RePad长针挑取细胞并转移到新板上,连续点种16个点,过程中不回到来源板,这形成6144个点,每16个点逐渐稀释接种物。用显微镜检查这些培养皿,并培养成菌落。

从培养的菌落来看,菌落直径约1毫米,连续接种导致转移细胞的数量逐渐减少,该方法可用于将接种密度降低到孤立的单细胞。琼脂-琼脂接种的细胞存活率通常很高,几乎相当于液体-琼脂接种。

一般来说,单个细胞和由此产生的菌落和微菌落都停留在由针的几何形状决定的空间边界内,因为衣藻在平板上是不活动的,而且几乎不需要喷雾或气溶胶就可以精确地进行操作。因此,这些程序适用于在有限的空间和耗材里,最大限度培养和转移衣藻。

 

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